fa بهینه سازی بیان اگزوتوکسین A (دومین I,II)نوترکیب سودوموناس آئروژینوزا، تخلیص و ارزیابی آن در آزمایشگاه علوم پایه Basic Sciences مقاله پژوهشی Orginal Research <p dir="RTL"><strong>زمینه و هدف:</strong> <em>اگزوتوکسین </em><em><span dir="LTR">A</span></em><em> فاکتور مهم در</em><em> بیماریزایی</em> <em>سودوموناس آئروژینوزا بوده و خنثی سازی آن در مبارزه با عفونتهای ناشی از آن کمک کننده خواهد بود. بنابراین</em> <em>در این مطالعه بهینه سازی تولید و تخلیص اگزوتوکسین </em><em><span dir="LTR">A</span></em> <em>(دومین </em><em><span dir="LTR">I,II</span></em><em>) و ارزیابی اولیه آن بعنوان کاندید واکسن مورد بررسی قرار گرفنه است.</em></p> <p dir="RTL"><strong>مواد و روش کار:</strong><em> بعد از استخراج </em><em><span dir="LTR">DNA</span></em>  <em>از سودوموناس آئروژینوزای سویه </em><em><span dir="LTR">PAO1</span></em> <em>و تکثیر با </em><em><span dir="LTR">PCR</span></em><em>، قطعه ژنی مورد نظر با اتصال به ناقل </em><em><span dir="LTR">Pet22b</span></em> <em>به </em><em><span dir="LTR">Escherichia coli BL21 (E.coli</span></em><em><span dir="LTR">)</span></em><em> منتقل و بیان آن با روش </em><em><span dir="LTR">SDS-Page</span></em><em> بررسی گردید و پروتئین نوترکیب با روش </em><em>افینیتی کروماتوگرافی تخلیص </em><em>شد. واکنش آنتی ژنیک آن با آنتی بادی ضد اگزوتوکسین </em><em><span dir="LTR">A</span></em> <em>و </em><em>سرم بیماران مبتلا به عفونت سودوموناس آئروژینوزا با روش وسترن بلاتینگ بررسی گردید.</em></p> <p dir="RTL"><strong>یافته ها:</strong> <em>بر اساس نتایج این مطالعه قطعه ژنی اگزوتوکسین </em><em><span dir="LTR">A</span></em> <em>(دومین </em><em><span dir="LTR">I,II</span></em><em>) سودوموناس آئروژینوزا با اندازه </em><em><span dir="LTR">bp</span></em> <em>1212 در ژل الکتروفورزمحصول </em><em><span dir="LTR">PCR</span></em> <em>مشاهده گردید که مقایسه توالی ژن کلون شده با توالی ژن اگزوتوکسین سودوموناس آئروژینوزای سویه </em><em><span dir="LTR">PAO1</span></em><em>، صحت توالی را تایید کرد.</em> <em>بیان در </em><em><span dir="LTR">E. coli BL21</span></em><em> باعث تولید پروتئین مورد نظر با اندازه تقریبی </em> <em><span dir="LTR">KD</span></em><em>45 گردید. بیان در شرایط مختلف نشان داد القای 4 ساعت با نیم میلی مولار</em><em><span dir="LTR">IPTG</span></em><em> در دمای</em><em><span dir="LTR">C</span></em><em>˚</em> <em>28 بهترین شرایط تولید پروتئین با غلظت بالا بود</em><em>. نتایج نشان داد این پروتئین در وسترن بلاتینگ با </em><em>آنتی بادی ضد اگزوتوکسین </em><em><span dir="LTR">A</span></em> <em>سودوموناس آئروژینوزای و سرم بیماران مبتلا به عفونت سودوموناس</em> <em>بخوبی واکنش نشان داد.</em></p> <p dir="RTL"><strong>نتیجه گیری:</strong> <em>سیستم استفاده شده سیستم مناسبی برای تولید اگزوتوکسین </em><em><span dir="LTR">A</span></em> <em>(دومین </em><em><span dir="LTR">I,II</span></em><em>) نوترکیب است و می تواند برای تولید این پروتئین در مقیاس بالا مورد استفاده قرار گیرد. </em></p> <p><strong><span dir="RTL">واژه های کلیدی:</span></strong><em><span dir="RTL"> سودوموناس آئروژینوزا، کاندید واکسن، اگزوتوکسین</span></em></p> <p><em>A<span dir="RTL">، واکسن نوترکیب</span></em></p> <p><strong>Background & Objectives:</strong><em>  P. aeruginosa exotoxin A plays an important role in virulence of the bacterium and its neutralization can abolish the P. aeruginosa pathogenicity. Therefore, we showed optimization of recombinant production and in vitro antigenic characteristics evaluation of exotoxin A (domains I and II) as a vaccine candidate.</em></p> <p><strong>Material & Methods:</strong><em> In this study, after DNA extraction and amplification with PCR, gene fragment was ligated to Pet22b vector and transferred to E.coli BL21. The protein expression was evaluated by SDS-PAGE method. The Ni-NTA affinity chromatography was used for recombinant protein purification. Then, the reactivity of recombinant exotoxin A with anti-exotoxin A antibody (Sigma) and sera from P. aeruginosa infected patients was evaluated by western blotting method.</em></p> <p><strong>Results:</strong><em> Sequencing of cloned gene showed that the sequence of exoA I-II gene was in accordance with exoA I-II from P. aeruginosa PAO1. SDS-PAGE analysis indicated that expression of recombinant protein with a molecular weight of 45kD. The results showed, 4 hours induction with IPTG = 0.5mM/m in 28˚C is optimum condition for expression protein. Western blot analysis of the purified protein demonstrated that ExoA I-II could be recognized by antibody against native exotoxin A and the serum of patients with P. aeruginosa infection.</em></p> <p><strong>Conclusion: </strong><em>These results suggest that recombinant exoA I-II protein can be produced in the laboratory and this system</em> <em>can be used for large scale production of this protein for subsequent immunological studies.</em></p> <p><strong>Key words<span dir="RTL">:</span></strong><em> Pseudomonas aeruginosa - vaccine candidate - exotoxin A-recombinant vaccine</em></p> سودوموناس آئروژینوزا, کاندید واکسن, اگزوتوکسینA, واکسن نوترکیب Pseudomonas aeruginosa - vaccine candidate - exotoxin A-recombinant vaccine 495 507 http://journal.nkums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-25-486&slc_lang=fa&sid=1 L Eftekharivash لیدا افتخاری وش 10031947532846004325 10031947532846004325 No S Farajnia صفر فرج نیا 10031947532846004326 10031947532846004326 No Sh Najar Peerayeh شهین نجار پیرایه 10031947532846004327 10031947532846004327 No A Tanomand اصغر تنومند tanomanda@yahoo.com 10031947532846004328 10031947532846004328 Yes